Spektrofotometri (UV-Vis)

1.  prinsip

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknis analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan dengan analisis kualitatif ( Mulja, 1995).

Spektrofotometri UV-Vis mengukur antaraksi yang terjadi antara radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom suatu senyawa. Pada umumnya serapan radiasi UV-Vis dihasilkan oleh eksitasi elektron ikatan, sehingga panjang gelombang serapan maksimum suatu senyawa itu dapat digunakan untuk penentuan kuantitatif senyawa yang mengandung gugus fungsi penyerap radiasi (Clarke’s,1986; DEPKES RI,1991;Mulja,1995; Skoog,1998; Rohman, 2007 ).

Bouger, Lambert, dan Beer membuat formula secara matematika hubungan antara transmitan dan absorban terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisa dan tebal yang mengabsorpsi sebagai berikut (Mulja, 1995; Fessenden & Fessenden, 1999):

                                                T = I­_t / I₀^-εcb

                                                A = log 1/T = ε. c. b

Keterangan:

          T = persen transmitan

          b = panjang lintasan

          I₀ =  intensitas radiasi yang datang

          I_t = intensitas radiasi yang diteruskan

          ε = absorbansi molar (Lr.mol^-1.cm^-1)

          c = konsentrasi (mol.Lt^-1)

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum Lambert-Beer ada beberapa pembatasan (Rohman, 2007):

1.   Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

2.   Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama

3.   Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut

4.   Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan.

     Penyerapan sinar UV-Vis dalam suatu molekul yang umumnya senyawa organik memiliki gugusan atom yang dapat mengabsorpsi radiasi elektromagnetik yang disebut sebagai kromofor, seperti asam organik (RCOOH), aldehid (RCOH), keton (RCOR). Pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsionil yang mempunyai elektron bebas seperti: -OH; -O; -NH_2; dan –OCH₃. Terikatnya gugus auksokrom dengan gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (pergeseran merah = batokromik) disertai peningkatan intensitas (efek hiperkromik). Suatu molekul yang sederhana apabila dikenakan radiasi elektromagnetik akan mengabsopsi radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai (Silverstein, 1986; Mulja, 1995; Rohman, 2007).       

Salah satu hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis yaitu panjang gelombang maksimum yang dapat dipengaruhi oleh pelarut dan struktur kimia yang mengandung kromofor. Lebih lanjut, pita-pita serapan maksimum biasanya juga lebar karena ada efek vibrasional. Dengan demikian, penentuan panjang gelombang maksimum yang tepat merupakan suatu hal yang sulit (Rohman, 2007).  

Serapan molekul di dalam daerah sinar UV dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereksitasi. Suatu keuntungan dari serapan UV adalah selektifitasnya, gugus yang khas dapat dikenal di dalam molekul dengan kerumitan yang bervariasi luas (Silverstein, 1986; Underwood, 2002). 

Hubungan antara energi yang diserap dalam transisi elektronik dan kecepatan (v), panjang gelombang (λ), dan bilangan gelombang (υ) pancaran yang menghasilkan transisi

                                                DE = hv = h c / λ

Dimana:

h   = tetapan Planck

v   = frekuensi

c   = kecepatan cahaya

λ   = panjang gelombang

 DE adalah energi yang diserap di dalam suatu transisi elektronik di dalam satu molekul dari suatu tingkat energi rendah (tingkat dasar) ke tingkat energi tinggi (tingkat tereksitasi). Energi yang diserap bergantung atas perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat tereksitasi; semakin kecil perbedaan di dalam energi, semakin besar panjang gelombang dari serapan. Kelebihan energi dalam tingkat tereksitasi dapat dihasilkan dalam disosiasi atau ionisasi dari molekul, atau mungkin dipancarkan sebagai panas atau cahaya. Energi yang dipancarkan sebagai cahaya terlihat dalam fluoresensi atau fosforisensi (Silverstein, 1986).

2.  Instrumen Spektrofotometer UV-Vis

    Spektrofotometer merupakan suatu instrumen yang digunakan unuk mengukur transmitans atau absorbansi suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, pengukuran terhadap sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal. Pengukuran dengan menggunakan instrumen ini dapat dikelompokkan menjadi dua bagian yaitu single-beam (berkas-tunggal) dan double-beam (berkas-rangkap). Namun dalam aplikasinya instrumen yang lebih banyak digunakan adalah double-beam karena pada umumnya mencirikan perekaman automatik terhadap spektra absorpsi (Underwood, 2002).

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat untuk mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar, 2003).

Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum UV-Vis terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang. Sinar UV mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sementara Vis mempunyai panjang gelombang 400-750 (Rohman, 2007).

Komponen dari suatu spektrofotometer, secara skema ditunjukkan dalam gambar sebagai berikut (Pecsok, 1968;Underwood, 2002):

a.       Sumber cahaya

Sumber energi cahaya yang digunakan pada daerah ultra lembayung-sinar tampak adalah sebuah lampu pijar dan kawat yang terbuat dari wolfram. Sumber lain yang biasa digunakan adalah lampu tabung hidrogen atau deuterium yang dapat digunakan pada panjang gelombang 175-400 nm. Dalam beberapa spektrofotometer dimungkinkan untuk saling menukar sumber wolfram dan lampu deuterium agar daerah UV-Vis dapat dijangkau sepanjang instrumen bekerja (Underwood, 2002).

b.      Monokromator

Monokromator adalah suatu alat optik yang digunakan untuk memilih berkas radiasi dan panjang gelombang yang digunakan. Monokromator terdiri dari 3 bagian utama yaitu celah masuk, elemen pendispersi dan celah keluar. Komponen-komponen monokromator adalah (Underwood, 2002):

1.             Celah masuk, berfungsi membuat satu berkas radiasi. Lebar celah biasanya bervariasi sehingga intensitas radiasi dapat divariasikan. Makin lebar celah, makin kuat intensitas radiasi.

2.             Cermin, berfungsi mengumpulkan radiasi yang datang dari celah masuk dan membuatnya menjadi berkas radiasi yang paralel.

3.             Elemen pendispersi, berfungsi untuk menguraikan radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang.

4.             Celah keluar, berfungsi memilih radiasi monokromatik untuk dilewatkan pada sampel. Lebar celah dapat divariasikan, tetapi makin lebar celah makin lebar pula pita panjang gelombang, padahal hal itu tidak diinginkan.

c.     Wadah sampel (kuvet)

Wadah sampel harus dapat meneruskan radiasi elektromagnetik pada daerah spektrum yang diinginkan. Sel kaca/plastik digunakan untuk rentang daerah sinar tampak, sedangkan sel kuarsa digunakan untuk daerah UV-Vis. Sel-sel harus diisi sedemikian rupa sehingga berkas sinar menembus larutan, dengan miniskus terletak seluruhnya di atas berkas (Underwood, 2002)

d.    Detektor

Detektor yang biasa digunakan pada spektofotometri UV-Vis adalah fotolistrik. Detektor ini berfungsi untuk mengubah sinar radiasi yang diterima menjadi sinyal elektronik (Underwood, 2002).

e.       Pencatat

Pencatat berfungsi untuk menerima dan merekam informasi yang diberikan oleh detektor (Fessenden & Fessenden, 1999).