Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau yang biasa disebut dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer, dan industri-industri makanan. Popularitasnya disebabkan oleh kekuatan pemisahannya yang tinggi, selektifitasnya yang sangat baik, dan banyaknya solut yang dapat dipisahkan dengan metode ini (Gandjar,2007).

1          Kegunaan KCKT

Kegunaan KCKT secara umum digunakan untuk memisahkan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. Selain  itu, dapat pula digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi, memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan polimer dan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran, kontrol kualitas, dan mengikuti jalannya reaksi sintesis (Rohman, 2007).

2          Prinsip Kerja KCKT

Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan baik pada fase normal atau fase terbalik mengunakan fase diam silika atau silika fase terikat yang terdapat dalam suatu kolom, sedangkan untuk fase gerak itu sendiri digunakan zat cair, akan tetapi pengunaan zat cair pada fase gerak mendapatkan kesukaran untuk mengalir didalam kolom, sehingga membutuhkan pompa bertekanan tinggi untuk dapat melalui kolom yang selanjutnya masuk ke detektor. Sampel dimasukan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fase diam maka solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dalam kromatogram ini terdapat jumlah puncak (peak) yang menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran (Hendayana, 2006).

            3          Instrumentasi KCKT

Pada dasarnya instrumen KCKT terdiri atas : yaitu wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel, pompa, kolom, detektor, dan rekorder (Gandjar, 2007).

        

a.       Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun botol-botol eluen yang dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan pereaksi dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam pereaksi dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Rohman, 2007).

b.      Injektor

Pemasukan atau injeksi sampel untuk analisis dengan metode KCKT merupakan tindakan yang penting. Walaupun kolom telah memadai, hasil kromatogram yang ditampilkan akan tidak memadai kalau injeksi sampel dilakukan tidak tepat. Ada tiga macam sistem injektor pada KCKT yaitu, injektor dengan memakai diafragma (septum), injektor tanpa septum, dan injektor dengan pipa dosis. Sistem dengan pipa dosis saat ini merupakan pilihan yang sangat tepat  pada KCKT khususnya untuk analisis kuantitatif (Mulya,1995).

c.       Pompa

Pompa dalam KCKT dapat diartikan sebagai jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fase gerak cair melalui kolom. Terdapat dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu pompa reciprocating dan pompa syringe. Pada pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur. Oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor  sensitif terhadap aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Sedangkan pada pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

Setiap pompa KCKT yang baik harus dapat melaksanakan sistem elusi dari isokratik yang sederhana sampai sistem elusi dari isokratik yang sederhana sampai sistem elusi dengan pemompaan otomatis yang sempurna.

 Sistem pompa kromatografi KCKT sudah diprogram untuk dapat melakukan elusi dengan satu atau lebih macam pelarut. Dikenal dengan dua sistem pompa pada KCKT, yaitu :

1.      Sistem elusi isokratik

Pada sistem ini elusi dilakukan dengan satu macam larutan pengembang atau lebih dari satu atau lebih larutan pengembang, dengan perbandingan tetap misalnya Metanol : air = 50 : 50 v/v

2.      Sistem elusi gradien

Pada sistem ini dilakukan dengan pelarut pengembang campur yang perbandingannya berubah dalam waktu tertentu misalnya Metanol : air = 40 : 60 v/v, dengan kenaikan kadar metanol 8% tiap menit (Mulja, 1995).

Pompa yang digunakan dalam KCKT harus dapat memenuhi persyaratan sebagai berikut :

1.        Menghasilkan tekanan sampai 6000 psi

2.        Bebas pengotor

3.        Kecepatan alir berkisar antara 0,1 – 10 mL/menit

4.        Bahan tahan korosi sehingga seal yang digunakan terbuat dari bahan baja atau teflon

5.        Alirannya terkontrol dengan reproduksibilitas 0,5%

(Hendayana, 2006)

d.      Kolom (column)

Kolom merupakan jantung dari KCKT sebab kunci keberhasilan analisis sangat bergantung kepada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisahkan senyawa dalam campuran yang kompleks (Mulya,1995).

Kolom dibagi menjadi dua bagian :

1.      Kolom Analitik    

Garis tengah dalam 2-6 cm, panjang begantung kepada jenis kemasan partikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.

2.      Kolom Preparatif 

Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm, kolom terbuat dari baja nirkarat. Kolomnya dapat berupa gelas atau baja yang tidak berkarat. Kolom gelas dapat menahan tekanan sampai 600 psi. Panjang kolom bervariasi 15-150 cm. Pengisi kolom biasanya adalah silika gel, alumina, dan elit. Pengisi kolom seperti partikel pelikular, yaitu butiran gelas yang dilapisi dengan materi berpori seperti silika gel, alumina atau penukar ion, juga sering digunakan (Pescok,1976).

Kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi merupakan bagian yang sangat penting, sebab separasi komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom. Oleh sebab itu harus diperhatikan dengan seksama tiga hal yaitu pemilihan kolom yang sesuai, pemeliharaan kolom, uji spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut merupakan kolom yang siap pakai). Kolom akan menjadi kunci penentu keberhasilan pemisahan komponen-komponen sampel serta hasil akhir analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi dibuat lurus (tidak dibuat melingkar sebagaimana kolom pada kromatografi gas ataupun bentuk U). Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi  suatu kolom (Mulya,1995).

Kolom dibuat dengan ukuran diameter sangat kecil (kolom mikro), dibuat dengan tujuan untuk memperoleh kepekaan menjadi lebih teliti, menghemat larutan pengembang, memperluas kemampuan detektor, sampel yang akan dianalisis sedikit. Sedangkan kolom yang dibuat pendek supaya menghasilkan resolusi yang baik, memperkecil harga diameter rata-rata partikel fase diam, waktu retensi (tR) atau mengurangi pengaruh bagian instrumentasi kromatografi cair kinerja tinggi terhadap hasil pemisahan (Mulya,1995).

Perbedaan jenis kolom pada KCKT adalah :

1.      Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom konvensional yang fase diamnya ”normal” bersifat polar, misalnya silika gel, sedangkan fase geraknya bersifat polar.

2.      Kromatografi Fase Terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar, kebalikan dari fase normal. Untuk mendapatkan fase yang non polar silika gel direaksikan dengan klorosilan Cl-Si-(R)n. Fase diam yang non polar yang banyak dipakai adalah jenis C₁₈, C₈, dan C₂ (Mulya,1995).

Keuntungan kromatografi fase terbalik adalah senyawa yang polar akan lebih baik pemisahanya pada kromatografi fase terbalik, senyawa yang mudah terionkan (ionik) yang tidak dapat terpisahkan pada kromatografi cair kinerja tinggi ”normal” akan dapat terpisahkan pada kromatografi fase terbalik, dengan kromatografi fase terbalik air dapat digunakan sebagai salah satu komponen pada pelarut pengembang campur (Mulya,1995).

e.       Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif) (Putra, 2004).

Ada beberapa persyaratan dari detektor ini, yaitu:

1.    Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

2.    Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil

3.    Tidak merusak sampel

4.    Tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut pengembang

5.    Stabil dalam pengoperasiannya

6.    Dapat bekerja dari temperatur kamar hingga 400^oC

7.    Mudah di dapat dan mudah pemakaiannya oleh operator

8.    Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (Gandjar, 2007).

Ada beberapa detektor yang digunakan pada KCKT, misalnya detektor spektrofotometri UV-Vis. Detektor ini paling banyak digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet (UV) dan sinar tampak. Selain detektor UV-Vis adapula detektor-detektor lain yang digunakan pada metode KCKT ini, misalnya detektor Fluorometer, detektor Ionisasi Nyala, detektor Elektrokimia, detektor Spektrofotometer Massa, detektor Refraksi Indeks, detektor Reaksi Kimia, dan detektor Photodiode-Array (PDA) (Putra, 2004).

f.    Rekorder

Hasil pembacaan dari detektor kemudian diolah oleh suatu prosesor dan dikirim ke perekam lalu perekam akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut kromatogram (Rohman, 2007).

Keuntungan utama metode KCKT adalah memiliki daya pisah tinggi, kecepatan tinggi, sensitifitas  tinggi, dapat dijalankan secara otomatis, dan berbagai pemakaian tidak dapat disamai oleh cara lain. Sedangkan kelemahan utama KCKT adalah harga perlengkapan yang mahal, dan diperlukan pengalaman untuk memperoleh hasil yang baik (Edward,1991)

g.      Waktu Retensi (tR)

Waktu tambat atau waktu retensi (retention time) adalah selang waktu yang diperlukan oleh senyawa pada saat diinjeksikan sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu retensi dinyatakan dalam satuan waktu (menit) dan memberikan arti yang sangat penting dalam analisis kualitatif dengan KCKT (Mulya, 1995).